W dniu 13.12.2017 mgr Jarosław Grządziel wygłosił w IUNG-PIB prezentację podsumowującą realizację półrocznego projektu pt. “Opracowanie wzorców molekularnych do szybkiej identyfikacji dominujących bakterii zasiedlających różne środowiska glebowe, z wykorzystaniem techniki elektroforezy w gradiencie środka denaturującego (DGGE)”.

Projekt realizowany był w ramach Dotacji dla Młodych Naukowców 2017, finansowanej przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego. 

Kierownik projektu: mgr Jarosław Grządziel,

Opiekun: dr Anna Gałązka

 

Badanie przeprowadzono z wykorzystaniem dwóch obiektów doświadczalnych. Jednym z nich były doświadczalne mikropoletka należące do Instytutu, na które składa się osiem różnych gleb, charakterystycznych dla Polski. Drugim obiektem była gleba skażona ropą naftową pobrana spod aktywnego szybu naftowego w Węglówce.

Pierwszym etapem badań była izolacja całkowitego DNA pochodzącego ze społeczności mikroorganizmów glebowych. Następnie przeprowadzono szereg reakcji PCR w celu dobrania optymalnych warunków powielenia hiperzmiennego fragmentu V3 genu 16S rRNA.

 

Otrzymane krótkie fragmenty DNA rozdzielono w żelu poliakrylamidowym z zastosowaniem metody DGGE, która umożliwiła zobrazowanie różnorodności mikrobiologicznej badanych siedlisk, w postaci prążków na żelu.

Do dalszych analiz wybrano siedem prążków pochodzących z rozdziału DNA wyizolowanego z gleb należących do doświadczenia mikropoletkowego IUNG oraz osiem prążków z gleby skażonej ropą. Prążki te wycięto z żelu za pomocą sterylnej końcówki do pipety, umieszczono w sterylnej probówce oraz dodano 100 ul buforu TE. Zawieszone w buforze prążki inkubowano przez 16 godzin w 4°C, następnie wytrząsano przy 600 rpm w 50°C, oraz odwirowano przy 12 000 x rcf. Eluat stanowił matrycę do reakcji PCR w celu reamplifikacji krótkich fragmentów DNA otrzymanych po wycięciu z żelu.

Kolejnym etapem było przeprowadzenie klonowania otrzymanych produktów PCR z wykorzystaniem szczepu Escherichia coli TOP10 oraz wektora pJET 1.2. Bakterie transformowane wektorem zawierającym przygotowany wcześniej produkt PCR zostały wysiane na podłożu LB z dodatkiem ampicyliny, w celu selekcji pozytywnej mutantów. Z każdej płytki wybrano po 10 losowych kolonii, z których wykonywano reakcje PCR z zastosowaniem tych samych starterów, które zostały użyte w pierwszym etapie. Produkty te następnie poddane zostały ponownej elektroforezie metodą DGGE w celu potwierdzenia, czy otrzymane produkty odpowiadają wysokością fragmentom DNA z których zostały wyizolowane.

         

Ostatnim etapem było sekwencjonowanie metodą Sangera otrzymanych produktów oraz porównanie uzyskanych sekwencji z dostępnymi bazami danych.

Przeprowadzone analizy potwierdziły, że dominującymi bakteriami w glebie są gatunki niehodowalne tradycyjnymi metodami. Należą one głównie do rodzajów Mucilaginibacter, Pedobacter, Pseudomonas w przypadku gleb uprawowych oraz Pseudomonas, Enterobacter, Raoutella, w przypadku gleby skażonej ropą. Wśród sklasyfikowanych, hodowalnych bakterii znalazły się zarówno bakterie potencjalnie przyspieszające wzrost roślin, takie jak Pseudomonas azotoformans, które mogą w przyszłości posłużyć do produkcji szczepionek bakteryjnych oraz bardzo groźne patogeny roślin np. Pseudomonas syringae, których obecność w glebach skażonych należy brać pod uwagę podczas prób rekultywacji gleb zdegradowanych.

 

Wyniki projektu były prezentowane m.in.:

• Na międzynarodowej konferencji:

  • Metagenomic approach to investigate the microbiota of different soil types. 7th International Weigl Conference, 26-29.09.2017, Lwów, Ukraina.
  • Identification of dominant bacteria in different types of soil using PCR-DGGE molecular standards. 7th International Weigl Conference, 26-29.09.2017, Lwów, Ukraina.

• Na krajowej konferencji:

  • Opracowanie wzorców molekularnych do szybkiej identyfikacji zmian populacji mikroorganizmów w środowiskach glebowych z wykorzystaniem metody DGGE. 51 Ogólnopolska Konferencja Naukowa, „Mikrobiologia środowiskowa szansą bezpiecznego życia i postępu biotechnologicznego”, 5-8.09.2017, Toruń-Ciechocinek.

 

JGrzadziel_Poster_Lwow
Sprawozdanie z realizacji projektu w ramach Dotacji dla Młodych Naukowców 2017
Tagged on:                 

Kontynuując korzystanie z witryny, wyrażasz zgodę na używanie plików cookie. więcej informacji

The cookie settings on this website are set to "allow cookies" to give you the best browsing experience possible. If you continue to use this website without changing your cookie settings or you click "Accept" below then you are consenting to this.

Close